资讯信息

需求:荧光素的优化
发布时间: 2015-12-04    浏览次数:9744次

一、企业基本情况

联 系 人

吕军英

职    务

科技项目主管

电    话

0574-87972799-832

手    机

18868903542

E - mail

Junying.lv@healthgenetech.com

所属县市区

宁波市高新区

企业情况简介

公司2011年8月成立,主营核酸(基因)分析、分子诊断类产品的研发、生产、销售及应用服务。

公司引进了在海外具有丰富的分子生物研发经验的技术人才,如已被评为浙江省“千人计划”创新人才吴勇博士,享受国务院特殊津贴的张兹钧先生,在海外具有近20年分子生物研究开发经验的医学博士南丽,在海外具有近20年从事生物信息学分析的专家罗勇博士。截止至2015年6月底,在本公司工作成员73人,其中博士6人,硕士研究生14人,本科生43人。团队中研发人员有32人,包括博士4人,硕士8人,本科生20人。

公司已建成约2500平米的新的研发实验室和配套设施,已购置了近2千万元研发设备;已建成一个符合GMP标准的1000平米10万级试剂盒生产净化厂房,包括8个组分生产车间及辅助设施,设计年检测能力上百万个样品。

公司以开展3个方向的DNA检测试剂的开发,分别是法医DNA检测试剂、病原体快速检测试剂和个体化用药指导的基因检测产品。公司目前是全球第三大法医DNA试剂厂商,法医产品已销往全球各地。除法医外,公司也已开发临床产品十几个,已申请发明专利27项,PCT专利3项,其中已授权发明专利达到21项。

除了体外诊断试剂之外,市场上对价为合适、性能高以及适合临床应用的仪器的需求也非常明显。因此,公司也开发了适合本公司试剂的仪器,该仪器具有体积小、适应强、应用广,符合临床需求的特点。

二、技术难题信息

技术难

题名称

荧光素的优化

所属技

术领域

生物医药

项目拟投入总额

60(万元)

已投入经费额

10(万元)

计划支付技术合作费最高额

 50(万元)

计划实施年限

2年

具体描述所急需解决的技术难题(请尽可能详细)

  1. 项目开发背景目前国内外研发现状和发展趋势,该技术(产品)主要优点和在技术上存在的不足

荧光素是一种合成有机化合物,外观为暗橙色/红色粉末,可溶于乙醇,微溶于水。在蓝光或紫外线照射下,能够发出荧光。这样一类有机化合物的分子常被用于抗体研究和寡核苷酸标记,目前常用于寡核苷酸标记的荧光素有FAM、JOE、TAMRA、ROX、HEX、TET等,还有一系列荧光素既能用于标记蛋白又能用于标记核酸如:Atto系列荧光素、Alexa Fluor系列、CAL Fluor系列等。

虽然很多荧光素的化学结构已经公开,国内外很多公司都能够按照结构式来进行合成,但随着核酸检测技术的发展,特别是基于荧光标记及荧光检测技术的发展,对荧光素的性能要求也越来越多。国外诸如美国应用生物(ABI)公司、英潍捷基(Invitrogen)、SIGMA等公司在荧光素研究和合成领域有着很深的积淀,合成了一系列信号强度高的荧光素并且都已申请专利,并没有公开结构式和对外供应,这就导致了这种技术在国内相关领域的应用受到了限制。

本公司是一家以开发体外诊断试剂盒及法医检测试剂盒的公司,这些试剂盒都是基于片段大小的多重PCR毛细管电泳检测技术来开发的,该类型电泳仪通常是基于荧光信号检测来反应PCR产物片段大小,因此极大的依赖于荧光素。

目前这种技术成本低廉,检测灵敏度高,准确度也高,一个反应可以同时检测多个靶点,因此有希望取代市场上昂贵的分子检测手段或其他基于抗体检测和培养法的手段。但是随着检测位点的增加特别是基于STR的法医检测试剂盒的开发,其对特定波长范围的荧光素及荧光信号强度都提出了苛刻的要求,目前满足这些要求的荧光素大都被国外公司保密,因此这将大大限制国内同类试剂盒的研发和应用。

 

2、技术难题主要内容(介绍该技术(产品)存在的主要问题,制约技术(产品)突破性发展的主要原因,今后产品在工艺、技术、方法、原理、材料、结构上发展趋势。着重介绍在技术上需要突破、发展、采用的新技术和解决的新问题)

目前荧光素存在的主要问题是荧光素种类少,特别是发射光为长波长的荧光素(625nm~640nm之间)且信号强度不能太低,这类荧光素市面已有产品太少在试用后大都无法满足法医STR检测试剂盒的需求,或是供应商小众供货周期长,价格比较昂贵。

针对目前试剂盒对这类荧光素的需求特点我们主要从以下几个方面来着手解决这些问题,第一种方案,根据对荧光素波长的要求可以化学合成一种发射光波长较长且在应用范围内的荧光素,并且信号强度较强,这类荧光素的合成主体结构仍是以现有长波长的荧光素为基础比如常用的TAMRA、ROX、Atto系列等,在这些荧光素结构母体上通过化学的手段将FAM、TET等偏蓝紫光吸光的化学基团引入到这类母体结构上,使其成为一种既能被蓝紫光激发的荧光素,且发射波长比较长,这类荧光素信号不仅强而且波长能满足试剂盒开发需求,总体上这类合成荧光素的特点是斯托克位移(stock shift)大。这是第一种解决这种需求的方案。第二种方案,通过荧光能量共振转移(FRET)技术来实现,荧光素的母体仍然是目前常见的发射光为长波长的荧光素,如ROX、TMARA等,但接下来我们采用能量转移的技术使得这类长波长的荧光素能够在检测仪器激发光488nm或505nm的条件下产生较强的荧光。具体是先将长波长荧光素通过化学连接的方式连接到寡核苷酸上,然后将FAM通过一种linker连接至长波长的荧光素上,常用的linker有C3、--S---S—等,其中两个荧光素之间的距离至关重要,太远不足以形成有效的能量共振转移那么就不能获得足够的荧光强度,距离过小同样也不会获得理想的共振效果,此外还需要考虑供体荧光素的淬灭效果,否则将会产生很强的背景干扰,因此需要对两种荧光素的共振距离进行摸索,这种方式解决这类荧光素需求的问题也被大部分厂商所采用,但目前都各自保密,因此有必要去探索一种属于自己的荧光能量共振转移体系。

此外,荧光素与寡核苷酸间的连接稳定性与合成后期HPLC的纯化都需要进行优化和改善,因为任何一种荧光标记的效率不可能是100%,因此需要将游离的荧光染料去掉,这就对我们的HPLC工艺提出了要求,从之前的一些荧光素的使用来看,这方面做的还不是很理想,还需要从荧光素本身结构和纯化方式上进行优化。

 

3、研究开发前期基础(介绍前期研究开发情况,包括已经开展过合作的单位、研究开发的技术路线和研究积累的经验等情况)

目前我们已通过与国内一些荧光素供应商进行合作,并初步通过上述两种方案,取得了一定进展。具体有通过与北京某公司合作对荧光能量共振转移(FRET)技术的探索已初步取得了一定的成果。此外我们还通过与宁波高新区的一家从事化学合成的公司进行合作,探索通过化学合成的方式合成一种斯托克位移较大的荧光素直接应用于寡核苷酸标记,目前正在试验阶段。

攻关目标(包括需要达到的技术指标等内容)

1.采用荧光能量共振转移技术的新荧光体系要求长波长荧光素信号强度强,荧光素间不产生相互干扰,且供体荧光要淬灭完全。荧光标记寡核苷酸后要求HPLC纯化干净在使用如ABI3130或3500遗传分析仪检测时无游离荧光素出现。

2.采用化学合成方式的荧光素,需对新荧光素进行检测验证包括在检测仪器激发光范围内,荧光信号强度要满足需求,新合成的荧光素不能在荧光体系中与其他荧光素产生相互干扰,还有新荧光素要适合寡核苷酸的标记,并能够溶于水。

成果形式(项目完成后要求技术输出方移交的成果形式以及知识产权等方面要求)

新荧光素结构专利,及相关应用领域论文一篇

 


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